QUÍMICA EXPERIMENTAL

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 PRÁCTICA 7. CROMATOGRAFÍA

Objetivo

Aplicar la cromatografía para identificar los diversos componentes de una mezcla basándose en el coeficiente de reparto de cada uno. 

Introducción

La IUPAC define a la cromatografía, como un método físico de separación mediante el cual los componentes de una mezcla se separan por distribución de dos fases: una estacionaria y otra móvil. El proceso de separación de cada sustancia es el resultado de un equilibrio entre dos conjuntos de fuerzas contrapuestas: las de propulsión, promovidas por el flujo de la fase móvil y las fuerzas de retención, originadas por la fase estacionaria. De este modo, cada sustancia migra de manera diferencial, conforme a sus propias características físicas y al tipo de fuerzas intermoleculares entre ambas. Así en el presente documento se tratará lo realizado durante la práctica de cromatografía. 


Procedimiento

-Cromatografía en papel


Primero se nos dio un pimiento morrón naranja del cual partimos un pedazo para poder triturarlo en el mortero, añadiendo un poco de etanol. Una vez triturado, obtuvimos la muestra que ocupamos más adelante.

Después se cortó papel filtro para poder introducirlo en los 3 tubos de ensayo, marcando un centímetro en la parte inferior de los papeles para indicar la posición en donde se pondrían las muestras. 




Luego, se llevaron los tubos de ensayo a la campana de extracción para ponerles 3 ml a cada uno del disolvente preparado que era una mezcla de éter, acetona y benceno.

Posteriormente, se añadió una muestra a cada papel filtro en la zona marcada de un centímetro, estas muestras eran del pimiento morrón naranja que trituramos primero, de espinaca y col morada que fueron preparadas por otros grupos.

Ya que los papeles tenían las muestras, los introducimos en los tubos de ensayo con la solución y los tapamos sin agitar para que la muestra pudiera correr naturalmente.





Cromatografía en columna


Para la cromatografía en columna primero tomamos dos pipetas Pasteur, hicimos dos pequeñas bolas de algodón y las introducimos en las pipetas por la parte de arriba y las empujamos hacia la punta de la pipeta con el fin de sellarla.




Después de haber sellado completamente la punta de la pipeta, a una de ellas la llenamos con sulfato de sodio hasta la hendidura de la pipeta.

Para que la cromatografía se lograra. Conforme se iba poniendo el sulfato de sodio se iba comprimiendo con la ayuda de una pluma. La otra pipeta fue rellenada con carbonato de calcio, se siguió el mismo procedimiento que con la de sulfato de sodio, se llenó y comprimió hasta la hendidura de la pipeta.




Se seleccionaron dos muestras, una de flor de noche buena y otra de betabel.

La muestra de flor de noche buena fue colocada en la pipeta con sulfato de sodio y se dejó correr. Se tomó la muestra de betabel y se puso en la columna que contenía el carbonato de calcio y se dejó correr.




Resultados

En la cromatografía en la que se utilizó espinaca, se obtuvieron cuatro bandas de diferente color a lo largo de la tira de papel, las cuales fueron (en orden creciente):


 

  • *Verde fuerte (Rf= 1.02)
  • * Verde bajo (Rf = 1.04)
  • *Amarillo (Rf = 1.09)
  • *Naranja(Rf = 1.11)

 


Mientras que en donde se utilizó pimiento naranja se tuvo como resultado dos bandas a lo largo de la tira depapel, las cuales fueron en orden decreciente:


 

  • Amarilla (Rf = 0.492)
  • Naranja  (Rf = 0.97)

 


En cuanto a la cromatografía en columna, en la que se utilizó sulfato de sodio la muestra de noche buena se separó en las siguientes bandas:


 

  • Rosa
  • Azul
  • Morado
  • Amarillo

 

En la columna de carbonato de calcio la muestra de betabel no se separó.




Discusión de resultados

 

La fase móvil consistió en la mezcla de benceno, acetona y éter de petróleo, los cuales tienen en común la característica de ser apolares. La fase estacionaria fueron las tiras de papel poroso ya que esta propiedad les confería un elevado cociente área superficial/volumen,con lo cual su interacción con la fase móvil sería mayor. Esto porque el papel,cuando se encuentra seco, contiene alrededor de un 5% de agua, así se forman finísimas capas de moléculas de agua en su superficie, las cuales se unen a los grupos hidroxilo libres de la celulosa, constituyendo la fase que adsorbe los solutos.


La razón por la que se utilizó la mezcla de disolventes apolares con una pequeña porción polar como eluyente se debió a que el soluto (pigmentos) estaba conformado por compuestos con una baja polaridad, los cuales se retienen poco en la fase estacionaria. Por tanto, el eluyente no sólo actúa como fuerza propulsora sino que, además, su propia estructura química contribuye a que los pigmentos puedan separarse mediante sucesivos equilibrios de adsorción-desorción. Si el mismo sólo estuviese constituido por un disolventeno polar, las clorofilas no se podrían separar ya que ambas cuentan con una estructura química similar, siendo su única diferencia la presencia de un radical metilo (clorofila a) y un grupo aldehído (clorofila b) que provoca una mayor polaridad de la clorfila b con respecto a la clorofila a.


De esta manera, las moléculas del soluto se absorben en la fase estacionaria, y a medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente de la fase móvil. La retención del soluto se debe a la competencia que se establece entrela fase móvil y éste, la cual radica en la polaridad de ambos. Entonces, los componentes del soluto más polares se retienen más rápido que aquellos con una menor polaridad. Para el caso en el que se utilizó espinaca, las bandas de colores que se formaron fueron, en orden creciente:


 

  • Verde fuerte (Rf= 1.02) Clorofila b
  • Verde bajo (Rf = 1.04) clorofila a
  • Amarillo (Rf = 1.09) Xantofilas
  • Naranja(Rf = 1.11) Carotenos

 


Tomando en cuenta lo mencionado, el pigmento verde fuerte es el de mayor polaridad, mientras que el pigmento naranja es el de menor polaridad.






 

En la cromatografía realizada con pimiento naranja, las bandas de colores en orden creciente fueron:


 

  • Amarillo (Rf = 0.492) Xantofilas
  • Naranja (Rf = 0.97) Carotenos

 


Por tanto, el pigmento amarillo es más polar que el naranja y por ello se quedó en la parte de abajo de la tira de papel.



 

 


Entonces es posible establecer que las interacciones que se dan entre los pigmentos que se encuentran más abajo de la tira del papel y la mezcla utilizada como fase móvil son del tipo dipolo-dipolo inducido ya que dichos pigmentos cuentan con cierta polaridad. Mientras que las interacciones entre los pigmentos ubicados en la parte superior y la fase móvil son fuerzas de London.






 

Respecto a la cromatografía en columna, los resultados no se observaron inmediatamente porque se requiere de un mayor tiempo debido las interacciones diferenciales que cada uno de los componentes de la muestra pueda ejercer con la fase estacionaria. Así, 14 horas después de realizada la práctica, las sustancias se separaron gradualmente formando bandas de diversos colores a través de la fase estacionaria. Al igual que en la cromatografía en papel, las bandas se van revelando de acuerdo a la polaridad de los pigmentos, las primeras bandas que se observen corresponden a los más polares, mientras que las últimas son de los menos polares ya que los más polares tienen una gran retención en la fase estacionaria debido a que el  sulfato de sodio y el carbonato de calcio tienen muy poca interacción con las sustancias poco polares.

En la columna en la que se utilizó sulfato de sodio aparecieron (de abajo hacia arriba) los siguientes colores:


 

  • Rosa (capsantina)
  • Azul   (Feofitina)
  • Morado (Antocianina)
  • Amarillo (Xantofilas)

 Esto indica la presencia de diferentes pigmentos, de los cuales el rosado es el de mayor polaridad y el amarillo es el de menor polaridad. Como se puede ver en la siguiente tabla, todos los pigmentos son polares, aunque dicha polaridad es baja. Así las interacciones que se establecen entre éstos y la fase móvil son del tipo ión-dipolo ya que la columna se encontraba compuesta por sulfato de sodio, el cual es una sal.





Para el caso de la columna en las que se empacó carbonato de calcio, la muestra no se separó ya que no se empleó una cantidad suficiente por lo que al pasar de las horas, se secó. Por tanto, para la próxima vez se debe considerar la aplicación de una cantidad de muestra que sea suficiente para que ocurra el corrimiento en la columna.


 

 Conclusión


La separación de los pigmentos mediante cromatografía se da a través de un mecanismo de adsorción física, dónde se establecen una serie de equilibrios de adsorción-desorción que dependen de la polaridad de cada pigmento y del tipo de fuerzas intermoleculares que pueden establecer con los componentes de la fase estacionaria y con la estructura del disolvente de la fase móvil. Así, la clorofila b, más polar que la a, se adsorbe más intensamente y presenta, en consecuencia, un factor de retardo (Rf) menor. Los carotenos, en cambio, son hidrocarburos y aunque la deslocalización de los electrones pi de sus estructuras generan fuerzas Van der Waals, no son lo suficientemente fuertes como para interactuar con la fase estacionaria, por lo que quedan disueltos en la fase móvil y son arrastrados por ésta, presentando en consecuencia, un factor de retardo mayor. Por tanto, La separación de los componentes de la mezcla se determina por las interacciones polares de los componentes de la misma con las fases estacionaria y móvil.


 

La adsorción se debe a interacciones intermoleculares del tipo dipolo-dipolo, dipolo-dipolo inducido o enlaces de hidrógeno entre el adsorbente y el soluto. Las moléculas de soluto se absorbenen los centros polares de la fase estacionaria y, a medida que se produce la elución, van siendo desplazadas por las moléculas de disolvente que constituyen la fase móvil. La retención de un soluto se puede justificar por la competencia que se establece entre el soluto y la fase móvil, la cual de pende de la polaridad de ambos.

 

Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la absorción.El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezclas o reaccionar químicamente con la misma.

 


Un ejemplo de su aplicación en biotecnología es la cromatografía por permeabilidad de gel, la cual es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entre cruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.


 

 

Cuestionario

1. ¿Cuál es el principio de las técnicascromatográficas?


R. La separación de los diferentes componentes de una mezcla que se encuentran en un líquido o gas es el resultado de las distribuciones diferenciadas de los solutos a medida que se desplazan alrededor o sobre una fase estacionaria líquida o sólida. Las diversas técnicas para la separación de mezclas complejas se fundamentan en la diversidad de afinidades de las substancias por un medio móvil gas o líquido y un medio absorbente estacionario (papel, gelatina, alúmina o sílice) a través del cual circulan. Así la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí.


2. ¿Cuáles fases constituyen un sistema cromatográfico y en qué consisten?

R.

 

 

Fase fija o fase estacionaria: la fase fija es el medio que permanece como soporte y sobre ella se realiza la acción de desplazamiento tanto de la fase móvil o fase de solvente y la fase de soluto. Esta consiste en partículas,generalmente sólidas, pequeñas y con una superficie micro porosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa.


Fase móvil (fase de solvente): solvente implicado en permitir el desplazamiento de la fase de solvente sobre la fase estacionaria.Su función es transportar a los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.


Fasede soluto: mezcla de sustancias sólidas que se pretende separar.


 


 

3. Parala cromatografía en papel ¿a qué pigmento corresponde cada mancha y cuáles son sus Rf?

R.


 

 

Espinaca:

 

  • Clorofila b (verde fuerte) Rf= 1.02
  • Clorfila a (verde bajo) Rf = 1.04
  • Xantofilas (Amarillo) Rf = 1.09
  • Carotenos (Naranja) Rf = 1.11

 

 


Pimiento morrón naranja:

 

  • Xantofilas (amarillo) Rf = 0.97
  • Carotenos (naranja) Rf = 0.492

 


¿Qué factores pueden afectar al Rf?

R. El grado de pureza del adsorbente, la concentración del ambiente de la cámara y la temperatura (Panreac, 2009).

 


5. Esquematice las interacciones moleculares obtenidas en cada prueba cromatográfica.


-Interacciones que se dan en la espinaca:




-Interacciones que se dan en la espinaca:



6. Mencione y fundamente 2 técnicas cromatográficas modernas.

R.


Cromatografía de afinidad: La cromatografía de afinidad separa las proteínas (analitos) en función de su especificidad de fijación de ligandos.Los ligandos de afinidad son moléculas poliméricas que sirven de soporte porque están unidas covalentemente sobre la columna cromatográfica o matriz inerte que debe de tener una estructura de poro abierta y estabilidad en condiciones de cambio de pH, detergentes y agentes disociantes, para así, retener y adsorber específicamente a las proteínas, la fase estacionaria es sólida. Estos ligandos se clasifican según su naturaleza química o su selectividad para la retención de analitos, esta última se clasifica en ligandos específicos (anticuerpos) y generales (como las lecitinas). 


Cuando las proteínas no específicas se han lavado a través de la columna, se eluye la proteína ligada con solución que contiene ligando libre. Después se introduce una nueva fase móvil que se desactiva, generalmente por el acoplamiento o alteración de los sitios activos inhibidor-ligando, para que esto pueda ser posible, se necesita un cambio en el pH, la fuerza iónica o la polaridad, debido a que estas condiciones modifican las características de los sitios activos, la finalidad de este proceso es hacer fluir a la proteína para continuar con la regeneración de la columna cromatográfica. La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de ser altamente selectiva para la retención de proteínas afines a la columna, para ello, emplea sistemas de baja presión, columnas cortas y un campo restringido para la separación.


 

Cromatografía de permeación en gel:  consiste en una columna cromatográfica empacada de tal manera que las de dicho empacamiento tienen diferentes tamaños de poros o de redes de poros con el fin de que las moléculas de soluto sean retenidas o excluidas basándose en su forma y tamaño y no en el peso molecular. Bajo este entendido, las moléculas de mayor tamaño no caben dentro de los poros y son arrastrados alrededor de la fase estacionaria, por lo que son excluidas y eluyen en el volumen de "cama devacío” de la fase móvil. Por el contrario, las partículas de menor tamaño eluyen hasta el final porque tiene más espacio de columna que recorrer debido aun fenómeno de difusión hacía los poros que tienen accesibles. Las moléculas detamaños intermedios tardan diferentes tiempos en eluir, debido a la cantidad de poros por los que puedan pasar.



 

Referencias


Panreac (2009). Cromatografía en capafina. Recuperado el 12 de febrero del 2012: http://www.panreac.es/spanish/practicas/practicas25.htm

 


 

 

 Fuentes de información


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Brown,T. (2004).QUÍMICA, LA CIENCIA CENTRAL (novena edición). Naucalpan, México:Prentice Hall.


Chang,R.(2007). Química (novena edición). Distrito Federal, México: McGraw-Hill


http://cimarron.mx/productos.html Recuperado el 12de febrero del 2012

 

 


http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf Recuperado el 12 de febrero del 2012


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http://permian.wordpress.com/2007/11/23/cromatografia-en-papel/Recuperadoel 19 de febrero del 2012


http://rua.ua.es/dspace/bitstream/10045/8246/7/T2cromagraf.pdf Recuperadoel 12 de febrero del 2012


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http://www2.uah.es/bioquimica/b-fbbma/notas1.pdf Recuperado el 12 de febrero del 2012


http://wwwprof.uniandes.edu.co/~infquimi/programaspdf/BLabQO-I.pdfRecuperadoel 12 de febrero del 2012


 

Torossi, Favio (2007). Unaexperiencia sencilla con fundamentos complejos: la separación de pigmentosfotosintéticos mediante cromatogragía en papel. Recuperado el 19 de febrero del2012: dialnet.unirioja.es/servlet/dcfichero_articulo?codigo=2510362


 


 

 

 

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